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中空多孔金纳米笼的制备、表征及其生物医学应用的初步研究

2019-12-06 19:51 来源:未知

  摘要:近年来,金纳米材料由于其优异的物理和化学性能,在癌症诊断与治疗领域中具有极大的发展潜力,受到了众多研究者的青睐。其中,具有中空、多孔结构的金纳米笼在近红外光区域具有良好的光散射和吸收能力,被广泛应用于光声波成像、光相干性断层扫描、药物靶向投送以及光热治疗领域。本文通过优化反应时间,合成了四种不同生长阶段的银纳米立方体,选择其中形貌最佳的银纳米立方体与氯金酸反应制备金纳米笼。然后通过调控加入氯金酸的量,合成了五种不同SPR峰值的金纳米笼,选择其中刻蚀程度最好的金纳米笼,对其光热效应进行了表征,并检测了其对HeLa细胞的毒性作用,最后探究了金纳米笼的光热治疗以及化学治疗应用。结果表明,金纳米笼具有较高的光热转换效率以及良好的生物相容性,是一种性能优异的金属纳米材料。

  关键词:金纳米笼、银纳米立方体、细胞毒性、光热治疗、化学治疗

  第1章 前言

  第1.1节 金属纳米材料概述

  纳米材料是指尺寸在纳米尺度范围(1-100nm)的材料,由于其具有显著的量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应以及宏观量子隧道效应,近几十年在光、电、磁等领域得到了蓬勃发展[1]。其中,金属纳米材料是纳米材料领域的一个重要分支,贵金属纳米粒子在光的存在下能引发金属表面自由电子的共振,使光场大幅度增强,从而表现出优异的光散射和光吸收能力,即局域表面等离子体共振(LSPR)现象[2]。这种独特的光学性能使得贵金属纳米材料在成像、传感、生物学和医学领域中应用广泛[3]。

  对于贵金属纳米粒子而言,形貌对其性质具有极大的影响[4]。目前,科学家们已经合成出了以各种形状存在的金属纳米材料,例如立方体[5-8]、笼[9-11]、球体[12]、棒[13-14]、星[15]、线[16]、片[17]等,这些金属纳米材料由于形状大小的差异,具有不同的性能,从而应用于不同的领域。

  第1.2节 金纳米笼概述

  1.2.1 金纳米笼的合成

  金纳米笼是一种具有中空内部和多孔薄壁结构的金纳米材料,目前,由夏幼南课题组提出的电化学置换法是制备金纳米笼最为广泛的方法,他们以银纳米立方体为牺牲模版,以PVP为稳定剂,通过置换反应

  加入四氯金酸后,置换反应首先发生在立方体表面能最高的位置,溶液中的金离子沉积在立方体表面,同时内部的银单质被置换成银离子进入到溶液中,逐渐形成中空的纳米结构。当继续加入氯金酸时,纳米笼框架中银的含量越来越少,将会导致金纳米笼的崩塌。因此,形貌完整的金纳米笼通常是由Ag-Au合金组成的。另外,金纳米笼的SPR峰值与其形貌密切相关[19],因此,我们可以通过调整加入的氯金酸的量以控制金纳米笼的SPR峰位。

  对于银纳米立方体的合成,同样由夏幼南课题组提出的多元醇合成法是目前最简便、高效的方法[6]。该法以PVP为稳定剂,Na2S为催化剂,乙二醇为溶剂和还原剂,将硝酸银还原为银单质,由于PVP能选择性的吸附在纳米粒子的{100}面,使得更多的银离子沉积在{111}面,从而形成锋利的立方体边角。本论文采用多元醇法合成银纳米立方体,然后再通过电化学置换反应制备金纳米笼。

  1.2.2 金纳米笼在生物医学领域的应用研究

  金纳米笼由于其中空内部和多孔薄壁的特殊结构,表现出许多优异的性质。例如,金纳米笼具有较大的散射截面以及较高的光热转换效率,而且它的SPR峰处在对生物组织损伤小的近红外区[20],再加上其本身就具有良好的生物相容性,笼内可用于装载药物分子,表面易于被PEG或抗体修饰,被广泛应用于生物医学领域。

  在肿瘤治疗领域中,靶向治疗具有至关重要的意义。2011年,夏幼男课题组在肿瘤小鼠模型中定量评估了PEG功能化的AuNCs的被动靶向作用[21]。他们在肿瘤小鼠体内注射PEG功能化的AuNCs,24 h后,AuNCs在正常肌肉和脂肪组织中的分布极少。而在肿瘤部位,由于EPR效应,PEG-AuNCs在血液的循环过程中不断累积,最后肿瘤中AuNCs的量是正常组织的3.6倍。同年,他们课题组还通过体内PA成像证明了AuNCs对黑素瘤的主动靶向作用[22],他们用[Nle 4,D-Phe 7]-α-黑素细胞刺激激素或[Nle 4,D-Phe 7]-α-MSH对AuNCs进行衍生化,结果表明 [Nle 4,D-Phe 7]-α-MSH-AuNCs对黑色素瘤中PA信号的增强了36%,比PEG-AuNCs(仅14%)强得多,实现了AuNCs的主动靶向,并且效率比被动靶向高2.5倍。

  金纳米笼在近红外区具有优异的光热转换效率,使得其在光热治疗领域倍受青睐。2004年,Chen等人首次证明了金纳米笼的光热效应[19]。2007年,他们利用anti-EGFR-AuNCs的光热效应产生的热量,成功地杀死了SK-BR-3乳腺癌细胞,实现了AuNCs的光热治疗的体外应用[23]。2010年,他们进一步将AuNCs的光热效应拓展到体内治疗中[24],他们在肿瘤小鼠体内注射PEG-AuNCs,然后对肿瘤部位进行激光照射,肿瘤温度迅速上升至55℃,并且肿瘤的代谢活性在24 h内降低了70%,表明该疗法对肿瘤的生长有明显的抑制作用。

  近几年,研究者们充分利用AuNCs的中空内部以及靶向作用,开发了一种新型药物运载工具。夏幼男课题组利用热响应聚合物对AuNCs表面进行功能化处理,然后在笼内装载药物小分子,赋予AuNCs控制释放的能力[25]。图1.2为该控制释放体系的运作示意图,当AuNCs受到NIR激光照射时,温度升高至聚合物的LCST,聚合物链裂解,打开孔并释放预先装载的药物,激光停止时,温度下降,聚合物链回到伸展状态,终止释放。为测试该体系的治疗效果,他们将装载有Dox的AuNCs与乳腺癌细胞混合并用激光照射5 min,结果发现细胞活性降低了60%以上,表明该体系具有良好的临床应用前景

  综上,金纳米笼集众多功能于一身,而且这些功能可通过化学手段集合在一个体系中,并与其他治疗手段相结合,如基因疗法[26]。该研究以硫辛酸作为中间连接体,将PEG-AuNCs与PEI连接,然后再通过静电作用与anti-miR-181b相连,如图1.3所示。结果表明PTPAuNC-NP可以有效地将抗miR-181b递送到靶位点以抑制肿瘤生长,并且在近红外辐射下能够发挥光热治疗作用,达到了更高的诊断和治疗水平。

  图1.3 金纳米笼与基因疗法相结合的原理示意图

  第1.3节 本课题研究的目的与意义

  金纳米笼具有多种优异性能,使得其在生物医学应用领域研究具有重大意义,本课题旨在通过优化反应条件,合成出形貌完整的金纳米笼,然后对其光热性能和载药性能进行表征,以初步探究金纳米笼在生物医学领悟的应用。

  第2章 金纳米笼的制备与表征

  第2.1节 银纳米立方体的制备与表征

  2.1.1 实验部分

  2.1.1.1 实验材料

  (1)原料与试剂

  AgNO3(99.9999%,Sigma-Aldrich),乙二醇(98%,Sigma-Aldrich),Na2S· 9H2O(98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),聚乙烯吡咯烷酮K30(Wt≈40000,梯希爱化成工业发展有限公司),丙酮(分析纯,江苏省强盛功能化学股份有限公司),18.1 M? cm超纯水。

  (2)仪器

  紫外-可见分光光度计(Agilent 8453),高速离心机(LEGEND Mirco21R,Thermo Scientific),磁力搅拌器(H03-A),温控仪,超声波清洗器(KQ-300E),透射电子显微镜(Tecnai G20, 美国,FEI),移液枪,50 ml三颈烧瓶,四氟乙烯搅拌子。

  2.1.1.2 实验方法

  (1)前期准备工作

  将50 ml三颈烧瓶与四氟乙烯搅拌子置于王水中浸泡2 h,然后在去离子水中浸泡30 min,用去离子水冲洗三次,最后置于干燥箱中烘干。

  (2)溶液配制

  由于Na2S和硝酸银在乙二醇易被还原,因此所有溶液都是在加料前45 min开始配制。

  PVP的乙二醇溶液(20 mg/ml):称取0.035 g PVP于5 mL EP管中,移取1.75 mL乙二醇加入其中,然后将EP管置于旋涡混合器上振荡,使PVP 完全溶解。

  Na2S的乙二醇溶液(3 mM):用药勺取一小块Na2S固体(约0.01 g)于5 mL EP管中,记录加入的Na2S固体的质量,并计算配置30 mM Na2S溶液所需加入的乙二醇体积,用移液枪移取相应体积的乙二醇加入其中,置于旋涡混合器上振荡使Na2S完全溶解。移取100 μL上述30 mM Na2S溶液于1.5 mL EP管中,加入900 μL乙二醇使溶液稀释10倍,置于旋涡混合器上振荡使其混合均匀,用铝箔纸包裹避光,置于冰箱中冷藏待用。

  AgNO3的乙二醇溶液(48 mg/mL):称取0.03 g AgNO3于1.5 mL EP管中,移取625 μL乙二醇加入其中,然后将EP管置于旋涡混合器上振荡,使AgNO3 完全溶解,用铝箔纸包裹避光,置于冰箱中冷藏待用。

  (3)反应过程

  移取6 mL乙二醇于三颈烧瓶中,放入搅拌子,将烧瓶置于加热套中,温度设定为150 ℃,加热1 h。移取70 μL配置好的3 mM Na2S溶液加入烧瓶中,同时开始计时,2 min后加入1.5 mL PVP溶液,在加入Na2S后的第8 min迅速加入0.5 mL AgNO3溶液,同时重新开始计时,观察溶液颜色变化,正确的颜色变化为黄色、橙色、橘红色、灰绿色。待反应时间达到8 min时,停止加热,将烧瓶浸入冰水浴中使反应立即停止。重复上述步骤三次,分别改变加入AgNO3后的反应时间为12 min、15 min、20 min,得到四种不同生长阶段的银纳米立方体。

  (4)洗涤与储存

  将冷却后的反应液转移至10 mL离心管中,用10 mL丙酮洗涤反应烧瓶,并将洗涤液转移至离心管中,将离心管置于旋涡混合器上使溶液混合均匀,然后放入离心机中,转速2000 g,离心25 min。取出离心管,用移液枪吸取上清液并弃去,加入2 mL超纯水,超声使其分散均匀。移取尽可能多的产物于1.5 mL离心管中,放入离心机中,转速9000 g,离心10 min。吸取上清液并弃去,加入剩余的产物,放入离心机中,转速9000 g,离心10 min,吸取上清液并弃去。当所有产物均已加入到相应的1.5 mL离心管后,超声将其分散于超纯水中,转速9000 g,离心10 min ,弃去上清液,重复三遍。最后,往洗涤过的沉淀中加入4 mL超纯水,超声分散,低温避光储存。

  (5)样品的表征

  紫外-可见吸收光谱:移取120 μL超纯水于干燥的比色皿中,测其光谱,作空白对照。移取10 μL上述制备的银纳米立方体溶液于1.5 mL EP管中,加入490 μL超纯水将溶液稀释50倍,将离心管置于旋涡混合器上混合均匀。移取120 μL上述稀释的溶液于干燥的比色皿中,测定样品的光谱。

  透射电子显微镜(TEM):用镊子夹取一片干净的铜网于垫有滤纸的玻璃皿中,喷有碳膜的为正面朝上,以同样的方法将步骤4中制备的银纳米立方体溶液稀释50倍,吸取10 μL样品滴加到铜网上形成液珠,盖住玻璃皿,置于超净工作台风干,制样后1~2天再拍电镜。

  2.1.2 结果与讨论

  2.1.2.1 银纳米立方体的生长过程

  为了研究银纳米立方体的生长过程,我们选取了0-12 min内的反应过程,在不同时间点反应溶液的颜色如图2.1所示,整个反应过程依次经历了黄色、橙色、橘红色、灰绿色四个阶段。初步推测反应初期的黄色溶液是未成形的银纳米粒子,随着时间延长,溶液颜色变红再变绿,银纳米粒子逐渐生长成有棱角的银纳米立方体。

  图2.1 制备银纳米立方体反应过程中的颜色变化

  2.1.2.2 不同形貌的银纳米立方体的紫外-可见吸收光谱

  不同反应时间合成的四种银纳米立方体的紫外-可见吸收光谱图如图2.2所示,反应时间为8 min、12 min、15 min、20 min的吸收峰值分别在405 nm、440 nm、450 nm、460 nm。可以发现,随着反应时间的延长,银纳米立方体的吸收峰红移。据文献记载,这是由银纳米立方体粒径的改变所导致的,银纳米立方体的尺寸增大吸收峰会发生红移 [6]。表明随着反应时间的延长,银纳米立方体的粒径呈增长趋势。另外,除了反应时间为8 min的光谱图以外,其余的光谱图在350 nm和380 nm处均有一个凸起的小峰,这是立方体棱角的特征峰[27],说明反应时间为8 min时,银纳米立方体的棱角还未生长完全。

  图2.2 不同反应时间的银纳米立方体的紫外-可见吸收光谱

  2.1.2.3 不同形貌的银纳米立方体的TEM图像

  图2.3为四种银纳米立方体的TEM图像,不同的反应时间代表了不同的生长阶段。反应时间为8 min时,仅有极少数的银纳米立方体,大部分的银纳米粒子的形状处于球形和正方形之间,即未生长完全的银纳米粒子,与UV-vis谱图描述的相一致。当反应停止在12 min时,几乎所有粒子全部生长成了形状规则、大小均一的银纳米立方体,通过Image-Pro Plus软件估算得到该银纳米立方体的平均粒径为45±5 nm,见图2.4。当反应时间延长至15 min,银纳米立方体继续生长,出现了部分大尺寸的银纳米立方体,导致了最终产物的尺寸不均一。并且,随着反应时间继续延长,这种尺寸上的不均一性越来越严重,不适于金纳米笼的合成。

  图2.3 a-d. 不同反应时间合成的银纳米立方体的TEM图像 a)8 min, b)12 min, c)15 min, d)20 min;e. 由Image-Pro Plus软件得出的银纳米立方体(12 min)的粒径分布图。

  2.1.3 结论

  本节采用Na2S介导的多元醇合成法合成了四种不同生长阶段的银纳米立方体,这四种银纳米立方体分别具有不同的形貌和尺寸,其中,反应时间为12 min的银纳米立方体的形貌最为规整,平均粒径在45 nm左右。已有文献表明,45 nm的金纳米笼的吸收截面大、光热性能优异[24]。因此,本论文选择反应时间为12 min的银纳米立方体作为牺牲模板制备金纳米笼。

  第2.2节 金纳米笼的制备与表征

  2.2.1 实验部分

  2.2.1.1实验材料

  (1)原料与试剂

  HAuCl4·3H2O(Sigma-Aldrich),银纳米立方体(第二章合成),聚乙烯吡咯烷酮K30(Wt≈40000,梯希爱化成工业发展有限公司),30% H202(分析纯,江苏强盛功能化学股份有限公司),浓HNO3(分析纯,江苏强盛功能化学股份有限公司),NaCl(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),18.1 M? cm超纯水。

  (2)仪器

  紫外-可见分光光度计(Agilent 8453),高速离心机(LEGEND Mirco21R,Thermo Scientific),磁力搅拌器(H03-A),温控仪,超声波清洗器(KQ-300E),透射电子显微镜(Taecnai G20, 美国,FEI),ICP-AES(Varian),移液枪,50 ml三颈烧瓶,10 mL容量瓶,四氟乙烯搅拌子,10 mL无菌注射器。

  2.2.1.2 实验方法

  (1)前期准备工作

  将50 ml三颈烧瓶与四氟乙烯搅拌子置于王水中浸泡2 h,然后在超纯水中浸泡30 min,用超纯水冲洗三次,最后置于干燥箱中烘干。

  (2)溶液配制

  PVP水溶液(1 mg/ml):称取0.007 g PVP于10 mL EP管中,移取7.0 mL超纯水加入其中,然后将EP管置于旋涡混合器上振荡,使PVP 完全溶解。

  HAuCl4溶液(0.1 mM):称取少量HAuCl4固体于15 mL EP管中,记录HAuCl4固体的质量,并计算配置10 mM HAuCl4溶液所需加入的超纯水体积,用移液枪移取相应体积的超纯水加入其中,置于旋涡混合器上振荡使HAuCl4固体完全溶解。移取100 μL按上述配置的10 mM HAuCl4溶液于另一15 mL EP管中,稀释100倍,置于旋涡混合器上振荡混匀,用铝箔纸包裹避光,置于冰箱中冷藏待用。由于HAuCl4不稳定,10 mM HAuCl4溶液应在配制完一周内使用,0.1 mM HAuCl4溶液仅能在配制当天使用。

  (3)反应过程

  移取5 mL配置好的PVP溶液于三颈烧瓶中,再移取100 μL第二章制备的银纳米立方体悬浮液于烧瓶中,将烧瓶固定在加热套上,设定温度为90 ℃,使溶液加热至微沸,并使其保持在微沸状态10 min以上。用注射器吸取8 mL 0.1 mM HAuCl4溶液,用铝箔包裹避光,手持注射器以约两滴每秒的速度向烧瓶中滴加1.25 mL HAuCl4溶液,观察溶液颜色变化,滴加完毕后使反应回流10 min至颜色稳定,然后将烧瓶置于冰水浴中冷却至室温。重复上述步骤三次,分别改变滴加的HAuCl4溶液体积为2.25 mL、3.75 mL、4.25 mL和4.75 mL,得到五种不同反应程度的金纳米笼。

  (4)洗涤与储存

  将反应液转移至10 mL离心管中,用超纯水洗涤烧瓶并将洗涤液倒入离心管,加入NaCl固体直至饱和,转速2000 g,离心30 min,移取上清液并弃去。加入大量超纯水使NaCl固体完全溶解,转速2000 g,离心30 min,移取上清液并弃去。重复上述步骤三次。将洗涤过后的沉淀超声分散于1 mL 1:1的乙醇溶液中,转速2000 g,离心30 min,移取上清液并弃去,最后将沉淀超声分散于500 μL超纯水中,避光储存。

  (5)样品的表征

  紫外-可见吸收光谱:移取120 μL超纯水于干燥的比色皿中,测其光谱,作空白对照。移取100 μL金纳米笼溶液,用超纯水将其稀释2倍。移取120 μL上述稀释的金纳米笼溶液于干燥的比色皿中,测定样品的光谱。

  透射电子显微镜(TEM):用镊子夹取一片干净的铜网于垫有滤纸的玻璃皿中,喷有碳膜的为正面朝上,以同样的方法金纳米笼溶液稀释2倍,吸取10 μL样品滴加到铜网上形成液珠,盖住玻璃皿,置于超净工作台风干,制样后1~2天再拍电镜。

  ICP-AES:①标准溶液配制:将10 mM HAuCl4溶液稀释100倍得到质量浓度为19.7 ppm的HAuCl4溶液,移取5.076 mL该溶液于10 mL容量瓶中,加入500 μL浓硝酸,加水定容,得到质量浓度为10 ppm的HAuCl4溶液;移取5 mL 10 ppm的HAuCl4溶液于10 mL容量瓶,加入500 μL浓硝酸,加水定容,得到5 ppm的HAuCl4溶液;移取2 mL 10 ppm的HAuCl4溶液于10 mL容量瓶,加入500 μL浓硝酸,加水定容,得到2 ppm的HAuCl4溶液。②样品配制:移取500 μL金纳米笼溶液于试管中,加入2 mL浓硝酸以及200 μL双氧水,置于90℃的加热板中加热3 h使其完全硝解,将溶液全部转移至10 mL容量瓶中,加超纯水定容。

  2.2.2 结果与讨论

  2.2.2.1不同形貌的金纳米笼的紫外-可见吸收光谱

  图2.4为合成的五种金纳米笼的紫外吸收光谱图以及对应的产物悬浮液图片。由图可知,随着HAuCl4溶液的加入,产物颜色变化过程为黄色、紫色、蓝色、绿色、灰色。加入1.25 mL、2.25 mL、3.75 mL、4.25 mL和4.75 mL HAuCl4溶液得到的金纳米笼SPR峰分别为510 nm、600 nm、735 nm、765 nm以及790 nm。可以发现,金纳米笼的SPR峰发生了红移,这是由于加入的HAuCl4越多,对金纳米笼的刻蚀程度就越大,如壁变薄或者孔增多,从而表现出不同的SPR峰特性,我们将继续通过透射电镜表征其形貌的变化。

  图2.4 加入不同体积HAuCl4溶液合成的金纳米笼的紫外吸收光谱以及对应的产物颜色图片

  2.2.2.2不同形貌的金纳米笼的TEM图像

  图2.5展示的是合成的五种金纳米笼的TEM图像,明显可以看出,随着HAuCl4溶液的加入或SPR峰的红移,金纳米笼的刻蚀程度是逐步加深的。对比可得,前两种金纳米笼有部分仍是实心结构,说明加入的HAuCl4还不足。图d中的金纳米笼(3.75 mL, SPR峰735 nm)从外观上看形貌较好,基本上所有粒子都是中空的,壁厚和孔隙比较均一,且分散性很好。通过Image-Pro Plus软件测量该纳米笼的边长为50 nm左右,壁厚约为5 nm,如图2.6所示。而当加入的HAuCl4溶液体积达4.25 mL时,纳米笼的边角开始变得不整齐,而且已有少部分金纳米笼出现了崩塌现象。随着HAuCl4溶液的继续加入,崩塌的现象越来越严重,以至于发生了团聚。这说明加入的HAuCl4的量过多,使得纳米笼中的Ag的含量太低,导致了崩塌。综上分析,3.75 mL HAuCl4溶液与银立方体反应得到的金纳米笼刻蚀程度最好,形貌最规整,并且它的SPR峰为735 nm,在近红外区内,与本实验室的激光器的NIR波长(808 nm)较接近,利于光热性能的表征。

  图2.5 加入不同体积HAuCl4溶液合成的金纳米笼的TEM图像。a. 0 mL;b. 1.25 mL(SPR峰510 nm);c. 2.25 mL(SPR峰600 nm);d. 3.75 mL(SPR峰735 nm);e. 4.25 mL(SPR峰765 nm);f. 4.75 mL(SPR峰790 nm)

  图2.6 SPR峰为735 nm的金纳米笼的TEM图像

  2.2.2.3 元素分布分析(Elemental Mapping)

  为了进一步表征金纳米笼的中空多孔结构,我们选择形貌最好的金纳米笼(SPR峰735 nm),对其进行了元素分布分析,结果如图2.7所示。可以看出,该纳米结构成分既有Ag也有Au,即是由Ag-Au合金组成的,且Au元素构成了纳米笼框架的主要部分,Ag则是散乱的分布在框架内部。

  图2.7 金纳米笼的元素分布分析图像

  2.2.2.4 电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)

  本论文采用ICP-AES法对金纳米笼的质量浓度进行了测定,测得金纳米笼的质量浓度为50 μg/mL。

  2.2.3 结论

  本节采用电化学置换法,通过调控加入的HAuCl4溶液的量,合成了五种不同刻蚀程度、不同SPR峰值的金纳米笼。利用透射电镜对五种金纳米笼的形貌进行了表征,结果表明SPR峰在735 nm的金纳米笼形貌和分散性最好。因此,本论文选择SPR峰为735 nm的金纳米笼进行下一章的应用研究。

  第3章 金纳米笼的光热治疗和化学治疗应用初步研究

  第3.1节 金纳米笼的光热性能和载药性能的表征

  3.1.1 实验部分

  3.1.1.1 实验材料

  (1)原料与试剂

  金纳米笼溶液(第三章合成),DOX(美仑生物技术有限公司),PBS(Hyclone),18.1 M? cm超纯水。

  (2)仪器

  恒温震荡仪(上海精宏实验设备有限公司),高速离心机(LEGEND Mirco21R,Thermo Scientific),808 nm近红外激光器 (MW-GX-808/5000 mW,长春飞秒),Flir E40红外热成像系统(E40,FLIR),405 nm激光光纤荧光光谱仪(AvaSpec-ULS2048-USB2)。

  3.1.1.2 实验步骤

  (1)金纳米笼的光热性能测试

  移取100 mL 2 μg/mL的金纳米笼溶液于1.5 mL EP管中,使用808 nm近红外激光器,调整功率密度为1 W/cm2,对准离心管中心照射5 min,用红外热像仪记录整个过程。测试完毕以后,以溶液的温度值为纵坐标,时间为横坐标,作图得金纳米笼在激光照射过程中的温度变化曲线。重复上述步骤,改变金纳米笼的质量浓度为5 μg/mL和10 μg/mL,测量不同浓度的金纳米笼溶液的温度变化曲线。

  移取100 mL 10 μg/mL的金纳米笼溶液于1.5 mL EP管中,使用808 nm近红外激光器,调整功率密度为1 W/cm2,对准离心管中心,照射5 min,用红外热像仪记录整个过程。测试完毕以后,以溶液的温度值为纵坐标,时间为横坐标,作图得金纳米笼在激光照射过程中的温度变化曲线。重复上述步骤,改变激光器功率密度为0.8 W/cm2、0.6 W/cm2、0.4 W/cm2,测量不同功率下金纳米笼溶液的温度变化曲线。

  移取100 mL 10 μg/mL的金纳米笼溶液于1.5 mL离心管中,使用808 nm近红外激光器,调整功率密度为1 W/cm2,对准离心管中心,照射5 min后关闭激光器,5 min后再开启,重复3次,用红外热像仪记录整个过程。测试完毕以后,以温度值为纵坐标,时间为横坐标,作图得金纳米笼在循环激光照射过程中的温度变化曲线。

  (2)金纳米笼的药物装载能力测试

  在1 mL的50 μg/mL金纳米笼溶液中加入25 μL 0.5 mg/mL DOX水溶液以及1 mL的PBS,作为对照,在2 mL PBS中同样加入25 μL的0.5 mg/mL DOX溶液,然后将混合好的两种溶液置于摇床上避光振荡12 h。将实验组置于离心机中,转速8000 r/min,离心10min,轻轻吸取上清液并转移至干净的EP管中,往沉淀中加入1 mL超纯水重新分散,利用激发波长为405 nm的荧光光谱仪测量实验组上清液和对照组溶液的荧光光谱。

  3.1.2 结果与讨论

  3.1.2.1光热性能测试

  为了测试金纳米笼的光热性能,我们绘制了金纳米笼在不同浓度、不同功率以及循环条件下的光热响应曲线,如图3.1所示。从图3.1.a可以明显看出,随着金纳米笼浓度的增大,光热响应越显著。由图3.1.b可知,浓度升高,升温速率增大。其中,10 μg/mL的金纳米笼温度上升至了53 ℃,足以作为光热试剂杀死细胞,而作为对照的水只上升了1 ℃。当改变激光的功率密度时,可以发现升温速率与功率密度也为正相关关系。图3.1.d为升降温循环曲线,三个循环过后,无明显衰减现象。综上表明,金纳米笼具有十分优异的光热稳定性,可以作为光热试剂进行循环使用。

  图3.1 金纳米笼的光热性能测试。a. 不同浓度的金纳米笼在功率密度为1 W/cm2的激光照射下的光热成像图片;b. 不同浓度的金纳米笼在功率密度为1 W/cm2的激光照射下的光热曲线;c. 10 μg/mL的金纳米笼在不同功率密度的激光照射下的光热曲线;d. 10 μg/mL的金纳米笼在功率密度为1 W/cm2的激光照射下的光热循环曲线。以上所有激光波长均为808 nm。

  3.1.2.2药物装载能力测试

  为了探究金纳米笼的药物装载能力,我们将AuNCs与DOX在PBS缓冲液中混合过夜,测量其上清液的荧光光谱,并以同样浓度的DOX的PBS溶液为对照组,测定其荧光光谱,结果如图3.2所示。两组光谱的荧光峰值均在580 nm,为DOX本身发出的荧光。可以看出,载药后上清液中DOX的荧光强度比同浓度的对照组低,由于浓度与荧光强度成正比,因此可以得出,载药后上清液中的DOX含量比同浓度的DOX更低,说明有部分DOX进入了金纳米笼中。但是,经计算得,在DOX浓度为0.5 mg/mL的情况下,载药量仅有13.8%,即平均每克AuNCs能装载0.62 g DOX(6.44×1021个DOX分子)。这是因为本实验中的载药只是一个相对扩散的过程, DOX从高浓度的溶液扩散到低浓度的金纳米笼中,由于没有封锁能力,DOX还可以从笼内再扩散出来,所以导致载药量较低。

  图3.2 载药后的上清液以及相同浓度的DOX溶液的荧光光谱

  第3.2节 金纳米笼的光热治疗和化学治疗研究

  3.2.1 实验部分

  3.2.1.1 实验材料

  (1)原料与试剂

  金纳米笼溶液(第三章合成),HeLa细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心),巯基甲氧基聚乙二醇(mPEG-SH,MW 5000),MTT,DOX(美仑生物技术有限公司),Triton X-100(Solarbio),DMSO(国药集团化学试剂有限公司),PBS(Hyclone),FBS胎牛血清(Excell),DMEM (Hyclone),双抗(Hyclone),18.1 M? cm超纯水。

  (2)仪器

  恒温震荡仪(上海精宏实验设备有限公司),高速离心机(LEGEND Mirco21R,Thermo Scientific),808 nm近红外激光器 (MW-GX-808/5000 mW,长春飞秒),多功能酶标仪(Infinite M200 PRO,TECAN),CO2细胞培养箱(Thermo Scientific),倒置显微镜(IX71, 日本 Olympus)

  3.2.1.2 实验步骤

  (1)金纳米笼的细胞毒性试验

  ①金纳米笼的PEG修饰

  为了防止金纳米笼发生团聚以及进一步提高它的生物相容性[28],我们在进行细胞毒性实验之前要先在金纳米笼表面修饰PEG。在1 mL 20 μg/mL的金纳米笼溶液中加入15 μL 1 mM的m-SH-PEG,在摇床上避光振荡过夜。转速8000 r/min,离心10 min,弃去上清液,加入1 mL超纯水重新分散沉淀。

  ②细胞毒性试验(MTT法)

  将处于对数期的HeLa细胞接种到96孔板中,控制每孔接种的细胞数约为1×104个,每孔接种的体积为100 mL(五组实验,每组6个孔,共30个孔)。在37 °C,5% CO2恒温箱中培养24 h后,用1×PBS缓冲溶液清洗两次,在1、2、3组每孔分别加入100 mL的 2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL金纳米笼的DMEM溶液,第4组每孔加入100 mL细胞培养基的细胞作为正对照,第5组每孔加入100 mL Triton作为负对照,然后在37 °C恒温箱中培养12 h。吸去培养基,每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 和90 μL培养基,继续培养4 h。轻轻吸取表面培养基,小心操作避免吸走甲臜晶体,每孔中加入150 μL的DMSO溶液,在摇床上避光摇晃10 min,将96孔板置于多功能酶标仪中,测量各孔在570 nm处的吸光度值,根据吸光度值绘制细胞毒性柱状图。

  (2)金纳米笼的体外光热治疗以及化学治疗效果测试

  将处于对数期的HeLa细胞接种到96孔板中,控制每孔接种的细胞数约为1×104个,每孔接种的体积为100 mL(七组实验,每组6个孔,共42个孔)。在37 °C,5% CO2恒温箱中培养24 h后,用1×PBS缓冲溶液清洗两次,在1、2组每孔加入100 mL DMEM溶液,3、4组每孔加入100 mL 10 μg/mL AuNCs的DMEM溶液,5、6组每孔加入100 mL 10 μg/mL AuNCs-Dox的DMEM溶液,第7组每孔加入100 mL 25 μg/mL DOX的DMEM溶液,加样后在37 °C恒温箱中培养6 h,然后用808 nm激光器对2、4、6组中的每个孔激光照射5 min,功率密度设定为1 W/cm2,放回恒温箱培养6 h。取出孔板,每个孔中加10 μL的5 mg/mL MTT 和90 μL的培养基,放回恒温箱继续培养4 h。轻轻吸取表面培养基,小心操作避免吸走甲臜晶体,每孔中加入150 μL的DMSO溶液,在摇床上避光摇晃10 min,将96孔板置于多功能酶标仪中,测量各孔在570 nm处的吸光度值,根据吸光度值绘制细胞毒性柱状图。

  3.2.2 结果与讨论

  3.2.2.1 细胞毒性试验(MTT法)

  为了探究金纳米笼的生物相容性,我们采用MTT法检测了它对HeLa细胞的毒性作用,将正对照组(仅加入了DMEM)中的细胞活性设为100%,由此计算实验组的细胞活性,结果见图3.3。可以看出,金纳米笼无明显的细胞毒性,当浓度达10 μg/mL时,HeLa细胞的存活率依然可以达到90%,表明制备的金纳米笼具有良好的生物相容性。

  图3.3在含不同浓度AuNCs的培养基中孵育12 h后HeLa细胞的存活率

  3.2.2.2 金纳米笼的体外光热治疗以及化学治疗效果测试

  最后,为了测试金纳米笼在体外的光热治疗效果以及化学治疗效果,我们分别探究了在有激光照射和无激光照射情况下,AuNCs和AuNCs-DOX与HeLa细胞共同孵育12 h后的细胞存活率,结果如图3.4所示。可以看出,对照组(仅有DMEM)在有激光照射的情况下,Hela细胞存活率为98%,说明激光对细胞伤害极小。当10 μg/mL 的AuNCs与细胞孵育时, Hela 细胞存活率为90%,说明 AuNC 具有很好的生物相容性,而在有激光照射的情况下, Hela 细胞存活率降低至70%,表现出明显的杀伤效果,表明AuNCs的光热治疗效果较好。当10 μg/mL 的AuNCs-DOX与细胞孵育时,细胞存活率为82%,而在25 μg/mL DOX存在下,只有40%的细胞存活,表明载药效果确实不太理想。然而,同浓度的AuNCs-DOX在激光照射下,细胞存活率降至了60%,显然这是光热治疗和载药治疗的协同作用的结果,表明这两种治疗方法的协同治疗效果要远优于二者单一治疗的效果。

  图3.4 在不同条件下孵育12 h后HeLa细胞的存活率

  第4章 结论与展望

  本论文通过优化反应时间,合成了尺寸均一的银纳米立方体,然后又通过调控反应程度,合成了形貌完整、孔隙均一的金纳米笼。随后,我们对合成的金纳米笼进行了细胞毒性、光热性能以及载药性能的表征,初步探究了金纳米笼在医学上的应用研究,结果表明金纳米笼具有良好的生物相容性以及优异的光热性能。但是,由于未被智能材料修饰的金纳米笼没有封锁小分子的能力,因此它的载药能力比较弱。倘若用智能材料对金纳米笼表面进行修饰,如热响应高分子[25]或相变材料[29],金纳米笼的载药能力可以大幅度提升。

  总体上来说,金纳米笼具有多功能特性以及众多调节性能的方式,是一种优异的金属纳米材料,非常适用于生物医学应用。更重要的是,金纳米笼的几种功能可通过化学方法集合在一个体系中协同发挥作用,并与其他治疗手段相结合,以达到更高的诊断和治疗水平。因此,金纳米笼在癌症诊断和治疗方面的多种应用上具有巨大潜力,相信在不久的将来,研究者们会开发出更多金纳米笼与新型治疗手段相结合的治疗方案,从而进一步提高人类的医疗水平!

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